兽用幼猪肾(BPK冈)传代细胞系的培育华南农学院畜医系刘福安在兽医科学上常用小动物来生产病毒性疫苗，但这种方法远远不能满足生产不断发展的需要，目前已逐渐用细胞培养来代替动物了。因病毒缺乏各种酶来合成本身繁殖所需要的核糖核酸，只能在活细胞内繁殖。人工培养离体细胞已有很长的历史，在五十年代以来已被广泛用于病毒学的研究，由于利用离体细胞繁殖病毒，可以节省大量试验动物，且不受动物体内防御功能的干扰，又便于显微观察，因此，被迅速地应用于家畜较常见的病毒性疾病诊断和疫苗生产。近十年来国外已应用细胞进行悬浮培养繁殖大量生产疫苗用的病毒，达到工厂化生产水平。为实现四个现代化，把昔医科学提高到一个新的水平，-对传代细胞系培育的研53究，是一个重要的课题。原代细胞株和传代细胞系新从动物体分离的细胞，从一个瓶转移到另一瓶继代，一般能够继续增殖，但继代次数有限，最终死亡。这种细胞称为原代细胞株。在一定的条件下，极少数细胞株能够发生变异而成为能不断继代的细胞，称为传代细胞系。原代细胞株只有贴附于培养壁上才能生长，呈单层生长，传代细胞系由于其贴附要求低一些，可以进一步培育使其发生变异而适应悬浮培养条件。以同一容积的培养瓶进行比较，悬浮培养的细胞数量比单层培养大得多，适宜大规模工厂化生产。因此，病毒性疫苗细胞化生产的先进水平，是指利用传代细胞系进行悬浮培养。要做到这一点，第一步要培育传代细胞系。近年来我国兽医部门曾引进PKl5和IB—I塔一2两个猪肾传代细胞系，但它们均需昂贵精制的氨基酸作营养。因此，必须研究用普通细菌营养液来培育传代细胞系，以利于推广。我们曾先后培育三个幼猪肾细胞株均未成功。自1974年底起用了15个月的时间培育出一瓶第六代的变异细胞(代号BPKl7)，以后不断继代培养，至今已离体三年并达第65代，每周能增殖8倍，生长速度大大超过原来的原代细胞株。目前已解决了细胞的超冷冻(一196℃)保藏，并正进行适应悬浮条件的培育工作。现就BPKⅣ传代细胞系的培养作以下简单介绍。材料与方法 jF。(一)謦皿清洁和灭曹。进行培育和盛液的玻璃瓶用肥皂水刷洗后，浸重铬酸钾硫酸洗液24小时，用自来水冲洗5次再用双蒸水冲洗2次，然后用双蒸才经120℃煮30分钟以上。烘千备用。使用前再经高压锅120"0进行1小时灭菌处理。(--)营养液。(所用药品均属分析试剂54级)成份1：2倍浓度Hanks液。制1000毫升用量如下。1第一液NaCI16．00克葡萄糖2．oo克KCl0．80克(20％液4毫升)Na2HP04·12H20O．24克(12％液2毫升) j酚红0．04克(O．2万液20毫升)KH。PO‘0．12克(6％液2毫升)加双蒸水至约600毫升第二液CaCl2·2H200．372克(18．6％液2毫升)加双蒸水至约100毫升第三液MgSO‘·7H200．40克(20％液2毫升)加双蒸水至约100毫升将第一、二、三液倒入量瓶并加双蒸水至1000毫升，摇舒，用5毫升注射器准确地分庄于链霉素空瓶，加胶塞但不塞紧，外包玻璃纸，用绳拴紧。在压力锅内120"C灭菌15分钟，置无菌箱内冷却后，不揭开玻璃纸而压紧胶塞。放37℃培养48小时，作无菌检验，再放4℃或室温保存备用。第四液NaHC033．5克加双蒸水至100毫升，配成3．5％溶液，分装于三个40毫升疫苗瓶，但不超过瓶容量80％为宜。选用完整胶帽塞塞紧，再加玻璃纸，用绳拴紧，在120℃灭。，菌15分钟，室温保存。成份2。1％水解乳蛋白液称1克水解乳蛋白，在容瓶内加双蒸水至100毫升，用蔡氏EK滤板正压滤过后，用100毫升注射器以无菌操作分5毫升装予灭菌小瓶謦内，并加塞、胶布再封腊。在56℃水浴置30分钟，然后在37"C培养48小时。无菌检验合格后，置于4℃或一20℃保藏备用。成份3 t猪血清用无菌操作从成年肉猪颈动脉放血于灭菌3000毫升三角烧瓶内。在室温静置数小时后用负压瓶抽去上层血清，可置于4℃24小时用同样抽取第二次血清。一般抽出的血清带有少量红血球，须置于4℃中待红血球沉底后，用正压法将上层血清压出作适当分装(10毫升、100毫升)于灭菌瓶，加盖、封蜡，在56℃水浴箱中灭fl甚30分钟，然后存放于4℃或一20℃备用。血清使用前须作无菌检验。临使用时，将以下成份混合即为营养液：2倍Hanks液(NaHC03除外)5．o毫升1％水解乳蛋白液5．O毫升3．5彤NaHC03(Hanks第四液)0．1毫升猪血清2．5毫升(三)原代细胞株的分离。取初生至几天龄乳猪，颈动脉放血致死。用无菌操作取下两肾，剥离包膜，弃去纤维组织较多的髓质部，将皮质部剪成几毫米直径的小块，用每毫升各含100单位的青霉素和链霉索的Hanks液冲洗2次以去除红血球，继续剪碎到尽量小的组织块，再冲洗2次。加入溶子Hanks液的0．3％胰蛋白酶，予37℃消化30分钟。尽量吸去上层清液，用含抗菌素的营养液轻轻地洗一次，再加入约100毫升的营养液，用滴管冲散搅匀，最后以1毫升量将细胞悬浮液分装于灭菌链霉素瓶，加胶塞封紧，放在5。倾斜度的木架上于37℃恒温箱进行培养。以后视酸碱度改变而换液，细胞生长少者，只换半量营养液，生长多者则全部换新液，一般维持在 pU7．1--7．2范围。(四)缝代方法细胞生长铺满培养瓶底达50％以上面积即可进行继代。瓶塞打开后，用2毫升注射器抽去旧营养液，再加入约1毫升0．02％乙二胺四乙酸钠(简称EDTA)液冲洗细胞表面，以清除残存营养液的钙离子、然后继续使用吸取旧液的注射器吸尽EDTA液。最后又注入0．1毫升EDTA液，加盖，置于无菌箱内的木架上数分钟至2小时以上，让细胞层逐步脱落。将部分或大部分细胞已脱落的瓶打开，注入2毫升营养液，用滴管作5--20次冲散操作，便将一半量即1毫升含细胞的营养液用滴管转移到以前盛Hanks液的链毒素瓶作为继代，另一半量留原瓶。新旧瓶封盖后又置37℃培养。除了污染和一个月以上不见细胞生长的瓶子外，都保留作培育之用。培育结果BPKⅣ细胞系育成过程，出现两方面的变化：(一)形态变化。经历三个阶段1．第一阶段。刚自动物体分离时，细胞能形成连续的单层，镜检时可见到近方形的类上皮细胞和纺锤状或星状的纤维母细胞，前者排列较密集，后者较疏松。继代下去，虽然两种细胞均趋向减少，但纤维母细胞相对地减少较快，以致于到了第五代几乎仅剩下一小片一小片的类上皮细胞了。此阶段约为5个月。2．第二阶段约占第6—15个月，细胞代次停留在第5—8代之间。那时只见到形成近园形的相不互连的细胞集落，细胞有一定的平行排列。据报导细胞定向排列是机体内细胞为了组成体积相适应的不同组织器官而固有的，在原代细胞株仍然保持的细胞“接触抑制”特性的表现。3．第三阶段。第15个月后个别瓶内出现形态有变异的细胞。除了生长速度较快之外，在显微镜下显得发亮，而原来的细胞则曼暗淡色。新型细胞的排列无定向，其集落一经相遇剐继续扩展而融合在一起，也可发现在原有细胞上再长一层新细胞。显然，细胞的“接触抑制”反应已消失。’(=)细胞生长速度的童化。在生势衰退柏原代细胞株的细胞群体里出现生长速度越来越快的细胞，是发生转向细胞系的变异的主要标志。虽然我们没有作详细的测量，但计算继代相隔时间可以提供关于其各代次生长速度的大概情况。从BPKⅣ细胞各代55-

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